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deplete 单细胞测序技术原理

2022-02-26 05:45:35 时政

单细胞测序技术于2009年问世。自2013年被《自然方法》评为年度技术以来,在科学研究中的应用越来越多。

2015年以来,10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现,彻底降低了单细胞测序的成本门槛。

此后,单细胞测序技术被广泛应用于基础科学研究和临床研究。单细胞在许多领域占有一席之地,对癌症的早期诊断、随访和个体化治疗具有重要意义。

一、基本原则

首先,单细胞测序并不是只对一个细胞进行测序,而是可以对单个细胞的基因组或转录组进行测序,可以理解为单细胞水平的测序。

在介绍基本原理之前,我们先试着回答一下:为什么要对单细胞进行测序?换句话说,单细胞测序技术能解决哪些传统方法无法解决的问题?

世界上没有两片完全相同的叶子。对于多细胞生物来说,细胞之间存在差异,通常在基因组和转录组上只有几分钱,在功能上有几千英里。

例如,在肿瘤组织中,肿瘤中心的细胞与肿瘤周围的细胞、原发灶和转移灶的细胞之间存在基因组、转录组等遗传信息的差异,导致免疫特性、生长速度、侵袭能力等方面的表型差异。在不同的肿瘤细胞之间,最终导致对不同抗肿瘤药物或放疗敏感性的不同。

那么我们如何研究遗传信息的异质性呢?传统的测序方法是在多细胞水平上进行的,这使得每个人都丢失了异质信息,而单细胞测序可以完美地解决这个问题。给你举个更生动的例子:

虽然这三个样本之间有如此多的差异,但我们得出的结论是,这个基因在不同组织中的表达基本相同。上图所示的异构信息完全忽略。

与western blot类似,传统测序方法显示的信息也是多细胞水平的平均信息,而单细胞水平的测序可以完整反映同一细胞群中不同细胞的基因组和转录组。

随着单细胞测序技术的出现,从混合样本中筛选异质信息的问题得以解决,该技术的成熟应用必将引领生命科学研究向前迈进一大步。

那么单细胞测序是如何实现的呢?以单细胞RNA-seq为例,我们将简要介绍实现该技术的原理:

1.分离单细胞,分别构建测序文库,测序。这种思维流量极低,成本极高。如上所述,燃烧大量金钱将测量几十个细胞,这往往不足以反映真正的科学问题。所以我们关注第二个选择。

2.基于标签的单细胞识别。它的核心思想是在逆转录过程中给每个细胞添加一个独特的标签序列,然后对其mRNA进行测序。这样,即使我们混合并测序,我们也可以认为携带相同标签序列的RNA片段来自同一细胞。利用这种策略,我们可以通过一次建立数据库来测量数万个单细胞的信息。

单细胞测序给大家带来了什么好处?就拿大家比较关注的单细胞RNA-seq来说:

1.在传统的研究方法中,我们经常根据标记基因和细胞形态来区分不同的细胞类型,但这种方法无疑是有争议的。单细胞测序技术可以更准确、无偏见地对细胞进行聚类。尤其是免疫学、肿瘤学和遗传学的研究将带来巨大的影响。

2.分析稀有细胞,尤其是特定时间空环境下的细胞。比如从环境中取样的微生物。

3.临床上,体外受精胚胎在着床前进行筛选。

4.基于循环肿瘤细胞诊断癌症,大力推广新型循环肿瘤细胞检测技术。尤其是治疗前后循环肿瘤细胞类型和数量的变化具有重要的预后价值。

5.已经通过传统的测序方法进行了大规模测序。希望利用这些数据冲击重量级期刊的小伙伴们注意,单细胞测序已经成为高评分期刊出版的井喷,再过几年技术会更加成熟。

2.要实现单细胞转录组测序,需要解决两个难题:

1.PCR偏倚:单个细胞含有约10pg的总RNA,80%以上的信息是rRNA。从单细胞RNA到文库,意味着核酸的扩增量要达到百万倍以上。然而,在这种高扩增水平下,不引入聚合酶链反应偏差始终是一个大问题。

我们可以考虑一下。如果两个样本的基因表达相同,但A和B的扩增效率分别为99%和97%,经过30个循环的扩增,两者相差1.84倍。我们在分析差异基因的时候,如果选择1.5倍作为差异基因的标准,那么没有差异的基因就会有差异。

2.去除rRNA:rRNA占总RNA的80%以上。如果不加区别地进行逆转录、再扩增和数据库构建,测序获得的大部分序列很可能是rRNA序列。但是,一般来说,如果你比较关注mRNA等编码基因的序列,rRNA序列并不能给我们带来有效的信息,这可以说是无用的。

分别介绍了以下三种单细胞转录组扩增技术:

SMART放大技术:

SMART扩增技术的核心技术是设计两个专用引物。结合MMLV逆转录酶进行逆转录。

专用引物1由中间的PolyT序列加上一个通用序列和3’端的两个简并碱基组成,但PolyT 3’端倒数第二个碱基是A、C、G而不是T,倒数第二个碱基是简并碱基。这样做的好处是可以在mRNA 3’端和Poly尾的连接处结合,但不能在mRNA的其他地方结合。这确保了逆转录的起始位置正好是mRNA 3’端的序列终止位置。MMLV逆转录酶有一个特点,当它转录到mRNA的5’端时,会在新合成的cDNA的3’端多加几个C碱基。

特殊引物2由一个通用序列和3’端的三个非脱氧G碱基组成,即RNA和RNA的G碱基,而不是DNA的G碱基。该引物可以与新合成的cDNA 3’端的几个碳碱基互补杂交,然后引导该MMLV酶再次进行聚合。复制的结果是获得双链cDNA。

这种双链cDNA的两端已经与我们设计的PCR引物序列连接,然后加入常规的PCR引物进行常规的PCR扩增和常规的PCR扩增,获得大量的DNA。然后,像传统的脱氧核糖核酸数据库一样,它可以被超声波中断,在计算机上建立和测序。

SMART技术获得的主要信息是mRNA信息,大部分LncRNA信息都会丢失。SMART技术对RNA的质量要求很高,如果RNA被降解,mrna 5’端的信息就会丢失。通用引物技术可以保证扩增的均匀性,但PCR引入的突变无法分析。

10×基因组学技术:

首先,将特定的脱氧核糖核酸片段接种在凝胶珠上,凝胶珠由三部分组成:条形码、UMI和多聚体。条形码长度为16个碱基。条形码有400万种,一个微珠对应一种条形码。通过这400万种条形码,可以区分凝胶微珠。UMI是一个随机序列,这意味着每个DNA分子都有自己的UMI序列。10个碱基长的UMI有100万种序列变化。UMI的功能是区分哪些读数来自原始的cDNA分子,基因片段是复制的还是重复的,以及它们是真正的SNP位点还是PCR产生的突变。单个细胞和单个凝胶珠用10×基因组学仪器通过油相混合在一起,形成油包水的小液滴,然后细胞膜破裂,释放细胞中的mRNA。游离的mRNA与液滴中的水相混合,也就是说,它与逆转录酶、结合在凝胶珠上的核酸引物和dNTP底物接触。

然后,发生逆转录反应。mRNA与凝胶珠上标记的DNA分子结合,在逆转录酶的作用下反向转录。将这种乳液中的水相全部泵出,也就是将所有标记好的cDNA分子全部泵出,然后将这些cDNA分子加入连接器,通过PCR扩增,制成illumina测序文库,放在Illumina测序仪上进行测序。测序后,对数据进行分析。

10×基因组学技术可以一次性获得大量的大细胞数据,但只能获得mRNA信息,LncRNA的大部分信息都丢失了。UMI技术可以很好地去除被认为是由分析和聚合酶链反应中的重复引入的单核苷酸多态性位点。RNA的质量也很高,降解也会造成5’-末端信息的丢失。

任何消耗技术

Anydeplete技术首先使用随机引物进行单链合成。核苷酸类似物被引入到单链合成中用于酶消化,核苷酸类似物也被引入到双链合成中以确保链特异性。然后,在两端添加一个接头,接头的一条链还携带用于酶促降解的核苷酸类似物。当形成单链文库时,设计特异性引物与rRNA形成的文库结合,经过一轮退火延伸,rRNA文库形成双链结构。反向接头上有特定的限制位点。当限制性位点被识别,接头被切断时,rRNA形成的文库没有完整的接头,而其他文库有完整的接头。通过PCR扩增和富集可以获得所需的信息,包括mRNA和LncRNA信息。和10×基因组学一样,any deliver技术包含分子标签,可以分析复制和PCR产生的突变位点。

anydelete技术可用于可降解样品,保证5’端和3’端信息的完整性,同时获得mRNA和LncRNA信息。如果只需要mRNA信息,anydelete技术会造成一些数据浪费。

参考:

1 . https://www . Sohu . com/a/332085879 _ 811044

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